Örnek Laboratuarlar Teknikleri

WESTERN BLOTTING YÖNTEMİ

Western Blot; dokudaki spesifik bir proteini analiz etmemizi sağlayan moleküler biyoloji tekniğidir.  Bu teknik sayesinde dokuda bulunan bir proteinın varlığı, büyüklüğü, konsantrasyonu, konsantrasyon değişimleri, farklı gruplar arasındaki konsantrasyonlarının karşılaştırılması vb. araştırılabilir.

NOT: Antikor kullanarak dokulardaki proteini tayin etmemizi sağlayan bir diğer teknik, immünohistokimyadır.

Blotlama yöntemeleri;
Western Blot: Protein tayini
Southern blot: DNA tayini
Northern blot: RNA tayini için kullanılır.

Western blotlama prosedürü dört ana kısımdan oluşur:

  1. Örneklerin Hazırlanması: Öncelikle ister in vitro (hücre kültürü, vb) ister in vivo (deney hayvanı çalışmaları) deneyler yapıldıktan sonra doku içerisindeki hücreler veya kültür hücreleri parçalanarak proteinleri içeren kısım diğer kısımlardan ayrıştırılır. Daha sonra elimizdeki protein karışımlarının protein konsantrasyonu spektrofotometre yöntemiyle belirlenir. Bu basamağın optimum uygulanması Western jelinin her bir kuyucuğuna eşit miktarda protein yükleyebilmemizi sağlar.
  2. Yürütme ve Transfer: Öncelikle proteinler denatüre edilip, indirgenerek düzgün yürütülebilecek hale getirilir. Daha sonra örnekler jel üzerindeki kuyucuklara yüklenerek, elektroforez yöntemiyle moleküler ağırlıklarına göre bantlar halinde ayrıştırılırlar (running) ve sonrasında bir membran üzerine aktarılırlar (transfer). Bu basamağın amacı antikorlarla işaretlenebilecek bir yapı elde etmektir (membran veya blot).
  3. İlgili Proteinin İşaretlenmesi ve Boyanması: İmmünohistokimyaya çok benzer bir şekilde blokaj, birincil antikor, yıkama, ikincil antikor, yıkama ve boyama kısımlarından oluşur. Görünür dalga boyundaki boyalar yerine kemiluminesan (kimyasal ışıma) işaretlenmesi kullanılır.
  4. Görüntüleme ve Analiz: Analog olarak bir filme veya dijital olarak CCD chip üzerine yapılabilir. Bantlar görülebilir ve analiz edilebilir hale getirilir. Önceki basamakların sorunsuz yapılmış olması bu basamağın da sorunsuz yapılabilmesini sağlar.

UYGULAMA

     İlgilenilen protenin bulunduğu dokunun karakteristiğine ya da proteinin bulunduğu hücresel bölgeye veya proteinin özelliğine göre pekçok farklı lizis tamponu kullanılabilir. Deney hayvanları ile yapılan in vivo deneyler sonunda beyin örnekleri genellikle RIPA buffer (Radioimmunoprecipitation assay buffer) ile homojenize edilir. Doku örneği tartılarak 10 katı kadar hacimde buffer eklenir. Proteaz inhibitörü RIPA’ya taze olarak eklenir. Çalışılacak proteinin fosforile olup olmamasına göre proteaz inhibitörünün içeriği değiştirilmelidir ve gerekli durumlarda fosfotaz inhibitörü de kullanılmalıdır, ilgili protein için literatüre bakılmalıdır.

Örnek;

  • 50 µg dokuya 500 µL RIPA eklenir, RIPA eklenmeden hemen önce:
  • 1/50 oranında (10µL) Proteaz inhibitör kokteyli ve
  • 1mM PMSF (elimizdeki solüsyondan 1/50 oranında, yani 10 µL) eklenir.

    
RIPA Buffer içindeki proteaz inhibitörü proteinlerin yıkılmasına neden olabilecek proteazların aktivitesini inhibe eder.

Homojenizasyon için homojenizatörler kullanılır. Örnekler 1.5 ml’ lik mikrofüj tüplerine konur. Homojenizasyon mutlaka buz içinde yapılmalıdır. RIPA ile doku tamamen karışıp, krema haline gelince işlem tamamlanır.
Homojenizasyonu takiben dokunun proteinli kısmını ayrıştırmak amacıyla santrifügasyon yapılır. Bunun için masaüstü tipteki santrifüjü kullanıyoruz.

Santrifüj: 14000 RPM'de, +4oC derecede, 15 dakika santrifüj edilir.
Üstte: Süpernatan (sıvı)
Altta: Pelet (çökelti)

Süpernatanlar ayrı birer mikrofüj tüpüne alındıktan sonra bir kere daha santrifüj edilebilir. Süpernatan mikropipet yardımıyla 0.5’lik mikrofüj tüplerine  eşit miktarda aliquotlanır ve  -80 oC’ de saklanır.

Spektrofotometre ile Protein Konsantrasyonu Tayini

Spektrofotometre ile protein abzorbansı ölçülür.

Bunun için Bradford yöntemini kullanıyoruz.
50 µl örnek (5 µl Süpernatan, 45 µl Distile su ile 10 kat seyreltilerek, bu oran eğer ölçüm sonucunda elde edilen absorbans değeri standart doğrunun dışında çıkarsa arttırılmalıdır, örneğin 20 kat), güzelce karıştırılarak mikroküvete aktarılır ve üzerine:

30 kat (1500 µl) Bradford protein assay reagent  (Sigma®, markaya göre protokol değişebilir) eklenir.

Örnekler ölçülmeden önce ilk olarak, standart protein solüsyonları (0,1-1,4 mg/mL arasında değişen) hazırlanarak bir standart grafik (protein konsantrasyonu-abzorbans grafiği) oluşturulur. Bu doğru protein ölçümü yapılmadan önce her seferinde yeniden oluşturulmalıdır.

Standartların hazırlanması (200 mg/mL stok BSA kullanılır)

1,4 mg/mL

2µL stok BSA + 283,8 µL Dsu

1 mg/mL

100µL 1,4'ten + 40 µL Dsu

0,5 mg/mL

80µL 1'likten + 80µL Dsu

0,25 mg/mL

80µL 0,5'likten + 80µL Dsu

0 mg/mL

50µL Dsu

Standart Grafik Hazırlanması:

[C]

A595

0

0

0,25

0,308

0,5

0,602

1

1,029

1,4

1,316

rsim

Daha sonra örneklerin abzorbans ölçümü yapılır. Karışım içinde çökelti oluşmaması ve partikül kalmaması gerekir, bunun için de önce örneği üzerine de Bradford çözeltisini koymak tavsiye edilir. Bradford eklendikten sonra tüp birkaç kez ters düz edilerek iyice karıştırılmalıdır.

Prensip: Bradford reaktifi içindeki “Coomassie mavisi’’nin, proteine bağlanmasıyla boyanın abzorbansı 465 nm’den 595 nm’ye kayar. Abzorbans değeri protein konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. BSA (bovine serum albumine) standart protein olarak kullanıldığında lineer konsantrasyon aralığı 0.1-1,4 mg/mL’dir.

Her bir beyin için elinizdeki 1550 µl'lik örneklerle 595 nm'de abzorbans değerleri ölçülür. Standart grafiğin eğim değerinden OD(optik dansite-abzorbans) değerini bildiğimiz proteinin C (konsantrasyon) değerini hesaplayabiliriz.

NOT: SP-8001 UV-VIS Spektrofotometre cihazının 9 numaralı menüsü QUANTITATIVE’ den cihaz önce hazırladığımız standart protein örneklerine göre standart grafiği çizer, daha sonrada bu grafiği baz alarak protein örneklerinin konsantrasyonlarını hesaplar. Ama bu özelliği olmayan cihazlar için standart grafiğin hazırlanması yukardaki şekilde yapılmaktadır.

Abzorbans değerleri ile protein yoğunluğunun hesaplaması:

Protein (mg/ml) = (Abzorbans/0.9929-standart grafiğin eğimi) x dilüsyon oranı

Yükleme için kullanacağınız örnekte ne kadar protein olmasını istediğimize karar veririz. Örn : 20-30-40 µg gibi. Az yüklemek düşük miktardaki proteinlerin gözden kaçmasına, fazla yüklemek ise kirli bir background’a ve analizde ciddi zorluklara sebep olabilir. Örnek olarak 20 µg’ı seçmişsek, örneklerdeki protein yoğunluğunu kullanarak (mg/mL), her bir örnekten hangi hacimde alırsak 20 µg protein almış olacağımızı hesaplarız (=20/Protein konsantrasyonu).

Kaç µl hacim ile yükleme yapacağınıza karar verin (20-30µl gibi). Yükleme için kullanacağınız solüsyonun %25'i Sampling buffer (4X) olmalı; hesaplanan miktarda örnek ekledikten sonra üzerini distile suyla tamamlayın.

Örn:   Abzorbans değeri 0.8 olan  bir örnekte protein konsantrasyonu, 8.06 mg/ml olarak hesaplanır. 

Yukardaki formülle :
20 µg protein yüklemeye karar verilmişse, 8.06 mg/ml yoğunluğundaki örnekten 2.48 µl almak gerekir.

30 µl yükleme yapılacaksa: Yükleme çözeltisi
2.48 µl örnek
+ 7.5 µl (30X0.25) sample buffer
hazırlanır
+ 20.02 µl distile su ile.

Yükleme çözeltilerine merkaptoetanol eklenir (%2.5 v/v, yani 30 µl için 0,75 µl). Merkaptoetanol, proteinlerin disülfit bağlarının indirgenmesini sağlar.

Sample buffer ise proteinleri denatüre hale getirerek merkaptoetanol ve kaynatma işlemleriyle birlikte proteinlerin denatüre olarak, jel üzerinde düzgün bir şekilde yürüyebilmesine olanak tanır.

Ependorflarda hazırlanmış yükleme çözeltilerini önceden 90oC’ye getirilmiş Dryblock’ta 5 dakika kaynatılır.

WESTERN JELİNİN (PAGE) HAZIRLANIŞI

Separation Gel  
Stacking Gel
ddW (İki kere distile edilmiş su)       ddW    
AC/BIS (Acrylamide/Bisacrylamide)     AC/BIS    
GB-1 (Jel Tamponu-1)       GB-2 (Jel Tamponu-2)        
SDS (deterjan)        SDS    
APS    Katalizör APS  Katalizör
TEMED TEMED

Akrilamid: Işık görmemesi gerekir, aluminyum folyo kağıdı ile tüp çevrelenir. Karışım, filtre kağıdı ile süzülür.

SDS (sodyum dodesil sülfat): Tüm proteinlerin eksi (-) yükle yüklenmesini sağlayan anyonik bir deterjandır.

Jel Kalıbının Oluşturulması

Çok iyi şekilde temizlenmiş ve alkol ile iyice ovularak tüm lekelerinden arındırılmış olan iki cam, aralarına iki çubuk (Spacer) yerleştirdikten sonra arka arkaya konarak düzeneğe yerleştirilir. Alttan sızıntı olmaması için aşağı doğru bastırılır. Sızıntı olup olmadığı az miktar “distile su” ile kontrol edilir.

Seperating Jel  karışımı hazırlandıktan sonra, pipetle hızlıca ama dikkatli bir şekilde  kenarından kalıpların arasına dökülür, bu esnada kabarcık oluşmamasına dikkat edilir. Bu işlem çok hızlı yapılmalıdır çünkü katalizörler eklendikten sonra jel solüsyonu 5-10 dakika içerisinde tamamen donmaktadır. Üst kısmın düzgün bir yüzey oluşturması ve hava almaması için 0,5 cc kadar “Bütanol veya İzopropopranol (alkol)” yavaşça eklenir.

Jel iyice polimerleştikten sonra konan alkol geri boşaltılır ve üzerine Stacking jel hazırlanarak aynı şekilde dökülür. Döker dökmez, son olarak “Tarak (comb)” yerleştirilerek jel polimerleşmeye bırakılır, böylece “Kuyular (well)” oluşturulmuş olunur.

Eğer hazır jel kullanılacaksa; Jelleri ambalajlarından çıkartılır, alt kenarlarındaki beyaz bantı sökülüp tarak çıkarıldıktan sonra, alt kenarları iyice temas edecek şekilde yerleştirilir ve vidalarla yerine sabitlenir.
           
***Hazır jel kesinlikle eldivensiz açılmamalı ve jele dokunulmamalıdır!!! TOKSiK (Sodyum azid var)!!!

Elektroforez sisteminin kurulması

500 ml yürütme tamponu (Running Buffer) hazırlanır. İç havuz (running chamber), 250 ml yürütme tamponu ile kuyucukları tamamen kapatacak şekilde doldurulur, içerisine 600 µl antioksidan çözeltisi eklenir (yürütme esnasında proteinlerin indirgenmiş halde kalmalarını sağlar). İç havuzdan tamponun sızma yapmaması çok önemlidir. Sızma yapmadığına emin olacak kadar beklendikten sonra, tamponun iç havuzda kaldığına emin olunduktn sonra, geriye kalan 250 ml yürütme tamponu dış havuza filling line çizgisine kadar doldurulur. Kuyucuklar mikropipet ya da pastör pipeti yardımıyla iyice temizleninceye kadar birkaç sefer bas-çek şeklinde yıkanır, çünkü kuyular polimerleşmemiş poliakrilamid jelle dolu olabilir. Bu şekilde kuyular arındırılıp, örneğin düzgün bir şekilde kuyucuğa oturması ve yürütme sırasında jele düzgün bir şekilde girebilmesini sağlar.

Örnekleri yüklemeden önce sisteme PRERUN (ön yürütme) yapılır. Prerun yürütmeye hazırlıktır, sample buffer hazırlanır, herbir kuyucuğa 5 µl sample buffer yüklenerek, sistemin kablo bağlantıları yapılır, 15 dak. 120 V.’ da yürütme yapılır. Boyanın jele düzgün girdiğinden, tüm kuyularda aynı hızda ve eşit olarak yürüdüğünden emin olunur. Böylelikle hem jelin homojenliği ve yürütmeye uygunluğu kontrol edilir hem de sistemden akım geçip geçmediği (akım geçtiğini kabarcıklardan anlıyoruz) kotrol edilmiş olur. Bu kontrolden başarı ile geçen jelin yürütmesi, boya jel tabanına gelince durdurulur.  Bu sefer örnekler kuyucuklara yüklenerek yürütme tekrardan başlatılır.

Yükleme için:

Yükleme yapmadan hemen önce kuyucuklar yürütme çemberinin içinde bulunan tampon çözelti ile iyice yıkanmalıdır. Mikropipetle her bir kuyuya, hazırladığımız yükleme örnekleri yavaşça ve sızdırmadan konur. Moleküler standart, ilk kuyucuğa 7-10 µl konulabilir. Diğerlerine 30 µl (kuyucuk hacmine bağlı olarak değişebilir) koymak idealdir.

Elektroforez:

Yürütme (Run): Yükleme yapıldıktan sonra dikey elektroforez sistemi kapak ile kapatılır, elektrotların doğru kutuplarda olduğuna emin olunur. Güç kaynağı çalıştırılır. Önce 80V akımla başlanır. Örneklerin yürümesi seperate jel ve stacking jel arasındaki sınırın altına geçtiği an akım arttırılır (120-130 V). Yaklaşık 1,5 saat boyunca örnekler jelde yürür. Moleküler ağırlığına bağlı olarak araştırılan protein poliakrilamid jel üzerinde istenen
düzeye ulaşılınca güç kaynağı kapatılır, yürütme tamamlanır.

Tamamı eksi yükle yüklenmiş olan proteinler westernde moleküler büyüklüklerine göre yukarıdan aşağıya doğru, yani eksiden artıya doğru hareket ederek ayrılırlar.

Genel bilgi: Proteinler; nötr, eksi (-) veya artı (+) yüklü olarak bulunurlar. Biz SDS ile proteinlerimizin hepsini eksi yükle yükledik. Jel yürümesinin bitimine yaklaşık yarım 
saat kala Transfer Buffer (20X) hazırlanır. Tek membran için 60 ml hazırlamak yeterli.

Belirlenen yürütme süresi bittikten sonra jel kalıpları vidalar gevşetilerek yerlerinden çıkarılırlar. Kalıbın üç kenarı hazır jellerde kırılarak açılır, dökme jellerde ise spacerlar çıkartılrak iki cam jele zarar vermeden gevşetilir ve  ortaya çıkarılan jelin üst kenarındaki kuyucuklar ve eğer alt kenarında kalıp dışına taşan çıkıntılar varsa, düzgün bir sekilde bistüri ile kesildikten sonra, jel parçalanmamasına özen gösterilerek çıkartılır.

Proteinlerin Jel’den Membrana Transferi

2 tür transfer membranı vardır;

  • Nitroselüloz membran
  • PVDF (Poli-viniliden florür)

Membrana, protein kontaminasyonunu engelemek için ne çıplak elle ne de eldivenle dokunulmamalıdır, iki filtre kağıtının arasından pens yardımıyla yırtılmamasına özen gösterilerek hafifçe alınıp, protokolün sonuna kadar temiz bir pens haricinde hiç bir şey ile membrana dokunulmamalıdır !
PVDF membran 30sn. Metanol’ de (metanol ve distile su) sallandıktan sonra, Transfer buffer' a konur. Shakerda (60rpm ile)10-20 dakika sallanır. Metanol, kutudan kuru çıkan membranın rehidrasyonunu sağlar.

Transfer Düzeneği 

Islak (wet) veya yarı kuru (semi-dry) transfer düzenekleri vardır . Bizim kullandığımız Yarı Kuru düzenektir.

Transfer makinesine birkaç kat kurutma kağıdı konup, iyice ıslanan kadar tranfer buffer dökülür, kabarcık kalmayacak şekilde üzerinden basılarak geçilir. Kuru kalmamasına dikkat edilerek membran, kurutma kağıdı üzerine konur. Jel, membran üzerine gelecek şekilde yerleştirilir. Islaklık ortamın elektrik geçirgenliğini oluşturarak üstten alta (eksiden artıya) doğru, yani jelden membrana doğru protein transferini sağlar.

Üstüne de kurutma kağıdı konup, transfer buffer eklenir. Arada kabarcık kalmaması önemlidir. Transfer makinesi güç kaynağı bağlanır; overnight için tek jel 40mA, çift jel için 80mA: 80 dakika için tek jelde 80mA, çift jelde 160 mA ayarlanır.

Transfer tamamlandığında güç kaynağı kapatılır, makineden kurutma kağıtları arasından membran, jelden ayırılarak alınır.

BLOKAJ

Blokaj, membranla antikorlar arasındaki Nonspesifik bağlanmaları en aza indirmek için uygulanır. Membranla antikorlar arasındaki Nonspesifik etkileşim alanının blokajı, membranı bir dilue protein çözeltisi içinde (BSA-Bovin Serum Albumin veya Yağsız Süttozu-TBST karışımı)  oda sıcaklığında 1 saat sallandırarak gerçekleştirilir.

Yağsız Süttozu-TBST solüsyonundaki proteinler membran üzerinde, hedef proteinden yoksun olan tüm bölgeyi kaplar. Böylece kullanacağımız primer antikorların sadece hedef proteinlere bağlanmaları sağlanır. Sonucunda zemin kirliliğinden kaynaklanan yanlış pozitif sonuçlar önlenir.

Membrana Birincil Antikor Ekleme

Membran, birincil antikor çözeltisinde gece boyu +4 oC (buzdolabında sallayıcıda (60rpm ile, zamanın sonsuza ayarlandığından emin olarak), sallandırılır.

Primer antikor çözeltisi yeniden kullanılmak üzere ayrılarak, membran yıkamaya alınır. 

Membranın Birincil Antikor Fazlasından kurtarılması:

Poşette bulunan membran üstündeki birincil antikor dökülür. Üstüne 20ml yıkama solüsyonu   veya TBST (TBS+ %0.1 Tween-20) eklenerek 3 kez 10 dakika  sallayıcıya konup sallanarak yıkama yapılır.
(TBST ayrıca antikorları sulandırmada da kullanılır.)

Membrana İkincil Antikor ekleme

Burada önemli olan, birincil antikor ve ikincil antikorun aynı hayvana karşı antikor barındırmasıdır. Yani birincil antikor hangi hayvanın antijenine karşı yapıldıysa ikincil antikorda da yine o hayvana ait olmalıdır.
Membran plastik poşete yerleştirilir. Kullanılacak ikincil antikorbelli bir oranda sulandırıldıktan sonra  membran üzerine dökülür ve poşet kapatılıp sallayıcıda 1 saat sallanarak bekletilir.

Membranı İkincil Antikor’dan kurtarma:
Poşette bulunan membran üstündeki ikincil antikor dökülür. Üstüne 20ml yıkama solüsyonu   veya TBST (TBS+ %0.1 Tween-20) eklenerek 3 kez 10 dakika  sallayıcıya konup sallanarak yıkama yapılır. Ardından distile suyla 2x2 dakika salanarak yıkanır.

Membran bir plastik şeffaf dosya ikiye ayrılarak, bir yaprağın üzerine konur. Kurumamasına dikkat edilir.

Kitteki Chemiluminescent substrat çözeltisinden 2 ml kadar, membran yüzeyine dokunmamaya dikkat ederek, steril bir pipetle, tüm yüzeye uygulanır ve reaksiyon için 5dak beklenir. Kemiluminesans ajanı, ikincil antikor ile aynı konjüge grubu taşımalıdır ve ikincil antikora bağlanarak ışıma yapar.

Kitte bulunan kurutma kağıdını membrandan üzerine koyarak fazla substrat alınır, membranın kurumamasına dikkat edilir.
Şeffaf dosyanın diğer yaprağını üzerine kapatarak, arada hava kabarcığı kalmadığından emin olunur.

Kodak 4000MM ımage Station'a yerleştirip, ışık kaynağı kapalıyken önc 10 dakika deneme çekimi yapılır. Görüntünün durumu gereği bu süre uzatılır ya da kısaltılır. Yukardaki gibi elde edilen bir görüntünün bant profilleri ise yine aynı cihazın programı ile analiz edilir.

Hacettepe Üniversitesi Nörolojik Bilimler ve Psikiyatri Enstitüsü
Sıhhiye Ankara
norobil@hacettepe.edu.tr
Sayfamızı 06.07.2005 tarihinden itibaren [ziyaretci sayisi] kişi ziyaret etmiştir.
Bu sitenin hazırlanmasında emeği geçen başta Dr. Çağrı Mesut Temuçin olmak üzere Dr.Emine Eren Koçak ve Dr.Müge Yemişçi Özkan’a, Canip Çağır ve Zülfiye Aydoğmuş’a, İngilizce çevirileri için Doç.Dr.Melike Mut, Doç.Dr.Neşe Dericioğlu ve Uzm.Banu Peynircioğlu'na  ve Bilgi İşlem Dairesi çalışanlarına teşekkür ederiz.